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抗衰老第二站：血浆中的青春信使——外囊泡
来源：产业创新人才培养中心
建设单位：个体化细胞治疗技术国家地方联合工程实验室（深圳）
时间：2025-01-17
从第二站开始，我们会给大家介绍多种抗衰老药物，从最新最前沿的到最成熟最广泛使用的。每种药物会结合相关文献，详细的解释实验开发过程中使用了哪些指标来证明其功效，而这些指标又为何可靠。力求让大家深刻理解药物的背景，更好自主评估它们的安全性和有效性。
外囊泡（Exosomes）是一种由细胞分泌的小型膜性囊泡，直径通常在30-150nm之间。它们来源于细胞内的多囊泡体（multivesicular bodies, MVBs），当MVBs与细胞膜融合时，其内部的小囊泡就会被释放到细胞外环境中，形成外囊泡。外囊泡的结构和功能在细胞间通讯中起着重要作用，能够携带蛋白质、脂质、RNA（包括mRNA、miRNA）等分子，这些分子随后可以被其他细胞吸收，从而影响受体细胞的生理功能。
《年轻血浆中的小细胞外囊泡（sEV）通过改善线粒体能量代谢逆转衰老相关的功能下降》这篇文章发表于期刊nature aging。是顶级生物期刊nature的衰老领域子刊，属于衰老领域最顶尖的期刊之一。
摘要
近期对异时性共生（heterochronic parabiosis）的研究揭示了年轻血液对老年组织的强大再生效果。然而，具体的再生机制尚未完全阐明。本研究中，我们证明了来自年轻小鼠血浆的小细胞外囊泡（sEVs）在分子、线粒体、细胞和生理水平上对抗已存在的衰老。将年轻 sEVs 静脉注射到老年小鼠体内，可以延长其寿命，减轻衰老表型，并改善多个组织中与年龄相关的功能衰退。定量蛋白质组学分析发现，年轻 sEVs 治疗后，老年组织的蛋白质组发生了显著变化，这些变化与代谢过程密切相关。机制研究显示，年轻 sEVs 通过其 miRNA 货物在体外和体内刺激PGC-1α表达，从而改善线粒体功能并减轻老年组织中的线粒体缺陷。总体而言，本研究表明年轻 sEVs 至少部分通过刺激 PGC-1α 表达和增强线粒体能量代谢来逆转退行性变化和与年龄相关的功能障碍
在摘要部分，作者提到其实验灵感源于异时性共生。所谓异时性共生，是指将两只不同年龄的动物的血液循环系统连接，先前的研究发现年轻个体的血液能够对年老个体产生有益的影响。在本研究中，作者发现年轻小鼠血浆的小细胞外囊泡（sEVs）能将老年小鼠的寿命延长，减轻衰老表型，改善多个组织的功能。机制分析表明这些变化主要与代谢过程相关，sEVs中的 miRNA 能够刺激PGC-1α表达，从而改善线粒体功能，减轻老年组织中的线粒体缺陷。
将整篇文章进行综合分析并整理，可以将文章整合成如图所示八大项，接下来逐一向大家讲解各项的详细内容。
衰老对大脑和骨骼肌的影响是非常严重的，会导致认知功能障碍和肌肉减少，作者做了三种行为学实验来研究年轻sEV注射是否可以迅速改善老年小鼠的认知表现和耐力能力。分别为①Morris水迷宫测试、②环境恐惧条件反射测试、③耐力测试。进行行为学实验的小鼠在两周内经过七次经脉注射200μL的PBS或年轻sEV。
①Morris水迷宫测试：设置一个淹水的圆形的水池，其中设置一个顶部与水面齐平的平台，小鼠被丢入水中后无法看到平台，但可以站在上面避免被水淹没，重复多次让小鼠记住位置后撤掉平台。实验共有三个指标1.潜伏期：小鼠放入水中到找到并爬上平台需要的时间。2.目标象限停留时间：撤掉平台后小鼠在原平台停留的时间。 3.平台穿越次数：撤掉平台后小鼠穿越原平台位置的次数。通过这三个数据可以有效的判断小鼠的空间学习和记忆能力。
与年轻小鼠相比，老年小鼠找到隐藏平台的潜伏期更长、在目标象限停留的时间更短、穿过平台的次数也更少。但在年轻sEV治疗后，老年小鼠的空间学习和记忆表现得到了改善。
②环境恐惧条件反射测试：当小鼠在一个特定环境中接受轻微电击后，会形成对该环境的恐惧记忆，小鼠再次进入该环境时会表现出冻结反应，也就是“被吓呆”了，这个“被吓呆”的时间与总时间的比值为冻结百分比。它能有效的反应小鼠对环境的关联记忆能力。
老年小鼠在情境记忆任务中表现出显著较低的冻结百分比，但经sEV注射后，老年小鼠的情境恐惧记忆显著增强。
③耐力测试：与前两种测试相比，耐力测试更为直观易懂。即让小鼠在跑步机上不停奔跑直至力竭，统计这个过程的耗时。
当然，真实的实验场景并不会像上图一样放一只猫追着老鼠跑，通常会采用电刺激等方法驱使其奔跑至力竭。
实验结果显示，年轻sEV对老年小鼠的耐力提升是非常显著的，将老年小鼠的总跑步时间延长到了29.19 ± 0.27分钟（增加了47.6%）。
这些行为学实验的结果表明，年轻sEV注射在短期内对老年小鼠的认知功能和耐力能力有显著的改善作用。
同时作者也进行了反向实验，即向年轻小鼠注射老年sEV，获得了完全相反的实验结果。具体而言，年轻小鼠在被注射老年sEV后表现出空间学习和记忆能力下降、情境恐惧记忆减弱以及耐力能力显著下降。反向实验结果进一步证明了sEV在衰老过程中对认知和耐力功能的重要调节作用。
寿命研究：进行抗衰老实验最直观的便是寿命实验。即将实验小鼠与对照小鼠一起饲养，直到全部老死，这样能直观地对比药物的延寿效果。实验使用了20个月的老年雄性小鼠进行注射实验，持续培养直至自然死亡。
寿命实验显示，每周注射年轻sEVs显著延长了老年小鼠的中位寿命12.42%。
在寿命实验的过程中，作者还发现，接受年轻sEVs治疗的老年小鼠比起未治疗的毛发会更黑更浓密且更有光泽。
虚弱：虚弱是一个相对比较难以量化的指标。为了将虚弱的指数定量化，作者使用非侵入性虚弱指数对小鼠评分，即对小鼠的一系列临床指标进行标准化打分，打分内容包括皮肤、肌肉骨骼系统、神经系统、心血管系统等。
虚弱指数的结果显示，sEV治疗显著降低了老年小鼠的虚弱指数，使得实际生理年龄为24个月的老年小鼠估计生物年龄下降为15.1个月。
结合寿命与虚弱研究来看，所有临床缺陷的迹象在年轻sEVs治疗的老年小鼠中都有所缓解，最明显的改善出现在皮肤和肌肉骨骼系统中。
为了对比年轻sEVs对器官组织的效果。作者综合检测对比了五项了全身生理的指标①生育能力、②代谢能力、③心脏功能、④骨结构、⑤脑组织。
①生育能力：生育能力是评价衰老情况的重要指标之一，随着睾丸功能的衰退，生物各项生育能力都会大幅度的降低。生育能力方面，实验由浅入深的对比了3项指标，分别为1.精子数量与活率。2.胚胎植入点。3.自由繁衍能力。
1.精子数量与活率：即采集小鼠的精子进行检测，结果显示老年小鼠的精子不管是数量还是活力在注射年轻sEV都得到了显著改善。
2.胚胎植入点：精子的数量活力的高低并不完能全能代表其生育能力的强弱，为了更直观的观察小鼠的生育能力，作者在特定环境中让适龄雌性小鼠与各实验小鼠交配12小时，然后在交配后4.5天通过注射血管蓝染料来可视化子宫内的胚胎植入点。实验结果显示，年轻sEV注射将老年小鼠的胚胎植入点从0提升到了3.4 ± 1.4个。
3.自由繁衍：虽然在胚胎植入点实验中老年小鼠没有胚胎植入点，但这并不代表老年小鼠已其完全丧失繁衍能力，为进一步检测其生育潜力，作者让各组小鼠与适龄雌鼠进行一个月的自由交配，观察最终产仔情况。年轻雄性小鼠平均每窝产仔8.4 ± 1只，而老年雄性小鼠平均每窝产仔4.4 ± 1只。注射年轻sEVs后，老年雄性小鼠的产仔数（平均7.8 ± 1只/窝）接近年轻雄性小鼠的产仔数。
②代谢能力：随着年龄的衰老，代谢会逐渐降低，为了检测小鼠的代谢能力，作者使用间接量热系统。即两个光暗周期下检测小鼠的1.氧气消耗（VO2） 2.二氧化碳产生（VCO2） 3.产热 4.自发运动量。
图中可看出这四个指标老年小鼠都是显著低于年轻小鼠的，而注射年轻sEVs部分恢复了老年小鼠的代谢健康。
③心脏功能：心脏是受衰老影响毕竟显著的器官之一，作者使用了超声心动图检查小鼠的心脏功能，共检测了四个指标1. 左心室（LV）质量。2.射血分数（EF）。3.缩短分数（FS）。4.左心室容积（LV Vol;d 和 LV Vol;s）。
1.左心室（LV）质量：随着年龄增长心脏为了维持正常功能会逐渐增厚，这会造成左心室质量的增加。
2.射血分数（EF）：是指心脏每次收缩时射出的血液量占舒张末期容积的百分比，反映了心脏的泵血功能。
3.缩短分数（FS）：是指左心室在收缩过程中直径缩短的百分比。FS减少表示心脏收缩能力下降。
4.左心室容积（LV Vol;d 和 LV Vol;s）：包括左心室在舒张末期和收缩末期的容积，这两个容积的增加通常表明心脏功能受损。
结果显示，在注射年轻sEVs后，心脏功能的四项参数都得到了改善。
④骨结构：随着年龄的增长，骨质流失是一种常见的现象，其原因有激素水平变化和骨吸收与骨形成的失衡等。作者检测了骨的四个指标1.骨量与组织量比（BV/TV） 2.骨小梁数量（Tb.N） 3.骨小梁厚度（Tb.Th） 4.骨小梁间距（Tb.Sp）。
骨小梁是骨结构中的网状成分，在骨骼的力学性能和代谢功能中起重要作用。随着年龄增长骨小梁的数量厚度间距都会发生改变，最终导致骨骼结构变得脆弱。
结果显示，注射年轻sEVs后，骨结构相关的四项参数也都得到了改善。
⑤脑组织：对于脑组织的检测，作者着重关注了两个脑区域：海马区和皮质脑区。这两个区域在学习、记忆和执行功能中起着关键作用。而且都在形态学水平上特别容易受到衰老的影响，即随着衰老加重这两个区域的体积会显著下降。
作者检测了两个指标：1.海马区与全脑体积的比值（Hip/whole brain） 2.皮质脑区和全脑体积的比值（Cortex/whole brain ）。
结果显示，注射年轻sEVs后，海马区和皮质脑区的萎缩都得到了显著的改善。
综合上面多个器官的实验结果所述，年轻sEVs具有将老年组织和器官的形态和功能恢复至年轻状态的能力。
衰老的一个最广为人知的贡献者是衰老细胞，即衰老细胞的积累会导致个体的衰老表型。所以对细胞衰老的水平检测是尤为关键的。
对于衰老细胞表型，作者共进行了六项检测①β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）。②p21和p16表达。③海马区的Ki67。④活性氧（ROS）水平。⑤晚期糖基化终末产物（AGEs）。⑥脂褐素。
①β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）：衰老细胞会开启酸性β-半乳糖苷酶的表达，这种酶被称为衰老相关β-半乳糖苷酶，其活性酶的存在表明细胞处于衰老状态。通过对各器官中的β-半乳糖苷酶进行染色，便能直观的看到它们的衰老情况，即颜色越深衰老细胞越多。
从图中可以看出心脏和肌肉SA-β-gal阳性细胞的比例很低，但是老年小鼠的肝脏、脾脏、肺、肾脏、海马和睾丸中比例都较高，但经过年轻sEV治疗后这些组织中的SA-β-gal染色水平迅速减少。
②p21和p16表达：p21 (CDKN1A) 和 p16 (INK4a) 是两种重要的细胞周期调控蛋白，它们都随着细胞年龄的增长而增加，是重要的衰老标志物。通过凝胶电泳对它们的检测，我们可以直观的看出各组织的细胞衰老水平，即图中上方的条带越清晰衰老细胞越多。
正如预期的那样，各种组织中的p21和p16表达水平在老年小鼠中显著增加，而短期的年轻sEV治疗显著减弱了这些组织中的p21和p16表达。
③海马区的Ki67：Ki67 是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，主要在细胞周期的 G1、S、G2 和 M 期表达，而在 G0 期（静止期）的细胞中不表达，因此可以反映细胞处于活跃增殖状态的程度。海马区是大脑中与学习和记忆密切相关的区域，其细胞增殖能力的下降是衰老的重要标志之一。通过检测海马区中 Ki67 的表达水平，可以评估该区域的细胞增殖活性，进而反映海马区的衰老状态，被染色的细胞越多证明增殖活性越强。
如图所示，老年小鼠海马区未发现被染色的Ki67阳性细胞，而年轻sEV的治疗缓解了老年小鼠的这一衰老表型，即再次出现染色细胞，增强了海马区细胞的增殖活性。
④活性氧（ROS）水平：活性氧是一类含有氧的高反应性化学物质，包括超氧化物阴离子（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、羟自由基（·OH）等。活性氧是细胞内的线粒体在代谢过程中产生的副产物。随着细胞衰老，线粒体功能障碍会导致的活性氧过量产生，因此检测活性氧水平也能判断细胞的衰老情况。
结果显示老年小鼠的各种组织中的细胞内ROS水平显著增加，但年轻sEV治疗使这一标志物恢复到年轻小鼠的正常水平，这表示其线粒体功能障碍得到了修复。
⑤晚期糖基化终末产物（AGEs）：AGEs是由还原糖（如葡萄糖）与蛋白质、脂质或核酸等大分子在无酶催化的情况下通过非酶糖基化反应形成的复杂化合物。AGEs 的积累是细胞和组织衰老的一个重要标志，与多种老年性疾病（如糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默病等）的发生发展密切相关。
结果显示，尽管老年小鼠的各种组织中的AGE含量显著增加，但年轻sEV治疗迅速消除了老年小鼠中过多AGE的积累。
⑥脂褐素：是一种不溶于水的、棕黄色的颗粒状物质，主要由细胞内的不完全氧化的脂质、蛋白质和多糖等大分子在溶酶体内积累形成。脂褐素的形成是一个渐进的过程，通常随着细胞和组织的衰老而增加。通过对组织的切片染色，可以直观的看到它们的衰老情况，即深棕色至黑色颗粒越多衰老细胞越多。
结果显示，老年小鼠的肝脏、心脏、肾脏和海马区表现出了强烈的脂褐素阳性染色。但在接受年轻sEV注射后深棕色至黑色颗粒显著减少，即高脂褐素积累的衰老细胞显著减少。
综合上面对衰老细胞的多个检测结果，我们能看出年轻sEVs具有使老年组织恢复年轻并抑制细胞衰老的能力。
通过前面四大项的实验，作者已经从细胞、个体和行为学表征等多方面综合证明了年轻sEVs的抗衰老能力。由于篇幅有限，后续的四大项机制研究没法展开详细分享，在此仅简单描述作者的后续实验思路。
作者后续通过蛋白质组学分析和基因集富集分析找出高生物学兴趣的富集术语或基因集，进而找出改善的衰老特征。简单的来说就是通过蛋白质发生的变化逆推基因变化，筛出基因变化高频词，再用高频词与衰老特征对比，找出sEVs具体影响的衰老标志。
作者共富集了五个GO术语聚类。其中2号和4号聚类的GO术语失调与衰老的三个典型特征密切相关，包括线粒体功能障碍、表观遗传改变和基因组不稳定性。因此在后续研究中作者主要针对线粒体和细胞呼吸进行了更深入的研究，最终证明了年轻sEVs通过其miRNA货物在体外和体内刺激PGC-1α的表达，从而改善线粒体功能并减轻老年组织中的线粒体缺陷。
整篇文章在证明年轻sEVs对老年小鼠的抗衰能力方面做得非常全面。从其2022年的投稿直至2024年才发表，以及大量附件图的使用，可以看出作者在投稿过程中与审稿人进行了长期的拉锯战，最终得以发表也是颇不容易。文章在某些层面仍存在不足，如在大脑研究中仅集中于海马区和皮质脑区，而未能涵盖更多区域。此外，后续的机制研究仅揭示了sEVs中miRNAs的关键作用，对sEVs中的其他成分未进行深入探讨。虽然进行了物种异质性研究，但该部分内容的数据量相对较少。尽管如此，文章依然通过翔实的实验数据和系统的研究方法，有力地证明了年轻sEVs在抗衰老方面的潜在作用。
参 考 文 献
[1] Chen, X., Luo, Y., Zhu, Q., Zhang, J., Huang, H., Kan, Y., Li, D., Xu, M., Liu, S., Li, J., Pan, J., Zhang, L., Guo, Y., Wang, B., Qi, G., Zhou, Z., Zhang, C.-Y., Fang, L., Wang, Y., & Chen, X. (2024). Small extracellular vesicles from young plasma reverse age-related functional declines by improving mitochondrial energy metabolism. Nature Aging, 4(6), 814-838.
https://doi.org/10.1038/s43587-024-00612-4